問(wèn)題

可能原因

解決辦法

轉膜不充分導致信號較弱

膜沒(méi)有完全均勻濕透

使用100%甲醇浸透膜

靶蛋白分子量小于10000

選擇小孔徑的膜，縮短轉移時(shí)間

靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉移緩沖液PH值

嘗試使用其他緩沖液

甲醇濃度過(guò)高

降低甲醇濃度或者使用乙醇/異丙醇替代

轉移時(shí)間不夠

對于厚的膠以及高分子量蛋白質(zhì)需要延長(cháng)轉移時(shí)間

洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數

阻斷不充分

增加封閉液孵育時(shí)間，或者提高溫度。

二抗濃度過(guò)高

降低二抗濃度

檢測過(guò)程中膜干燥

保證充分的反應液

曝光過(guò)度

縮短曝光時(shí)間

抗體與阻斷蛋白有交叉反應

檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無(wú)交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應

沒(méi)有陽(yáng)性條帶或條帶信號較弱

抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長(cháng)孵育時(shí)間

酶活降低甚至失活

直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內，有活性的酶聯(lián)物

標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設置陽(yáng)性對照，如果陽(yáng)性對照有結果，但標本沒(méi)有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因

試劑不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過(guò)設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性

一抗失效

選擇在有效期內抗體，并選擇現配現用的工作液

洗膜過(guò)度

縮短洗滌時(shí)間

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

抗體活性降低

選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長(cháng)時(shí)間放置

蛋白轉移不充分

見(jiàn)上述

封閉過(guò)度

減少封閉劑的量或縮短時(shí)間，換用不同封閉劑類(lèi)型

曝光時(shí)間過(guò)短

延長(cháng)曝光時(shí)間

條帶位置（大小）不對，或有非特異性條帶

二抗的非特異性結合

增加一個(gè)對照：不加一抗，其他操作過(guò)程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來(lái)源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的）

一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性

蛋白降解

使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑，實(shí)驗中增加內參

蛋白二聚體或多聚體存在

增加蛋白質(zhì)變性過(guò)程及強度

抗體濃度過(guò)高

降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶

蛋白上樣量過(guò)大

降低樣本上樣量

背景斑駁

封閉劑中有聚集體

使用前過(guò)濾封閉劑

HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體

過(guò)濾二抗試劑，去除聚集體

膜上出現反像

HRP含量過(guò)高

降低酶聯(lián)二抗的濃度